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菌群移植:概念、方法学和实现现代化的策略

2018-12-05

简介  

本文翻译自Protein Cell杂志(IF=6.23)发表的“Microbiota transplantation:concept, methodology and strategy for its modernization(点击即可进入原文链接)?#20445;?#35813;文由“标准化HMT研究组”署名发表,文章所涉及HMT标准化研究过程电镜照片入选本期杂志封面,主题是“say bye to crude HMT”。


摘要

菌群移植(Human Microbiota Transplantation,HMT或FMT)已成为近年来生物医学和临床医学的研究热点。已有多种疾病从HMT治疗中获益,包括艰难梭菌感染、炎症性肠病、糖尿病、癌症、肝硬化和肠脑相关疾病等,良好的HMT临床疗效为菌群-宿主间相互作用在多种疾病中的意义提供了关键证据。总结从古到今利用微生态治疗人类疾病的经验,?#26434;?#25512;动HMT标准化的发展及未来具有重要意义。本文将从HMT到配方菌群移植概念的变化、方法学发展和HMT升阶治疗策略等方面进行综述,并陈述专家观点。


引言

菌群移植是证明菌群与许多疾病存在相互作用的直接证据,近年来已成为生物医学和临床医学的研究热点(Khoruts and Sadowsky 2016; Lynch and Pedersen 2016; Vindigni and Surawicz2017)。 HMT治疗复发性艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection,CDI)已被列入临床治疗指南(Surawicz et al., 2013)。此外,许多研究揭示了其在治疗难治性溃疡性结肠炎(Cui et al., 2015b; Kellermayer et al., 2015; Moayyedi et al., 2015; Rossen et al., 2015)、克罗恩病(Zhang et al., 2013; Cui et al., 2015a; Shimizu et al., 2016; Bak et al., 2017; He et al., 2017a, b)、便秘 (Tian et al., 2016)、肠?#20934;?#32508;合征(IBS)(Johnsen et al., 2018)、肝病(Kao et al., 2016; Bajaj et al., 2017; Philips et al., 2017; Ren et al., 2017)、血液病(Kakihana et al., 2016; Spindelboeck et al., 2017)、自闭症(Kang et al., 2017) 和癫痫(He et al., 2017a) 等疾病中的潜在治疗价值。检索美国官方临床试验注册机构网站(www.clinicaltrials.gov),截至2018年3月底,已有或正在进行的关于HMT的临床试验有200多项,多数是在过去两年中注册的。这些临床试验主要集中在研究HMT在治疗CDI以外的适应证,如炎症性肠病(IBD)。只有少数研究目的在于分析HMT的方法学、临床决策、安全性和成本效益。一项多学科研究(Stallmach et al., 2018)表明,各国临床医生对是否应该对IBD患者实施HMT治疗的观点不一。有关CDI和IBD以外适应证的更多问题仍有待解答。我们已经踏上了标准化HMT的漫长旅程。本综述将从总结文献及专家观点的角度讨论菌群移植的概念变化、方法学发展和管理策略。


菌群治病历史

HMT成为医学突破,既不是技术也不是理论的突破,而是认识的突破。微生物测序、生物信息学技术以及对菌群整体观的理解为揭示复杂的菌群内在属性提供了新的直观证据(Dubilier et al., 2015; Madsen et al., 2017)。但是,目前针对菌群的深入研究仍非常有限。最近越来越多的研究提出使用阴阳理论来解释肠道菌群的复杂生态系统 (Gibson et al., 2014; Wu et al., 2016; Starkel et al., 2018)。根据这一理论,肠道中有害菌和有益菌之间建立了阴阳平衡,这是两个相互矛盾的力量相互补充并相互促进的过程(Cui and Zhang 2018)。一旦这?#21046;?#34913;被打破,病原体?#31361;?#20405;入机体导致疾病的发生。


HMT的历史可追溯到至少公元四世纪的中国(Zhang et al., 2012b)。在东晋时期(公元300 - 400年间),葛洪在所著的“?#38381;?#21307;学”书《肘后备急方》(Ge 2000) 中详实记载了使用粪便悬液治疗危重疾病,包括:食物中毒、瘟病和伤寒等。HMT的古籍依据按以下标准考证:(1)用人粪便来源的物质给人治病; (2)给药途径是经消化道; (3)推测是以新鲜粪水或发酵粪便中存活的功能菌群发挥疗效;(4)文字记载的方法、适应证、疗效可鉴。葛洪在他的书中清楚地记载了这种治疗方法,表明HMT可能早于当?#26412;?#24050;用于民间医学。伴随腹泻和脓血便的“瘟病”和“伤寒”是难治性疾病(Li 2011)。据李?#38381;?#20110;1578年所著的《本草纲目》记载,新鲜或发酵的粪水可用于治疗伴随高热、中毒、脓肿、痰湿、滞食的“瘟病”或“内热”(Li 2011)。《重订通俗伤寒论》(Xu 2011)记载了使用粪便溶液或儿童粪便治疗?#29616;?#33145;泻的“伤寒”。这种疗法在中国现代老一辈专家中仍在用于治疗难治性疾病。根据Yang等在2014年的调查,中国使用粪便治疗的悠?#32654;?#21490;可能有助于中国医生高度接受HMT(Ren et al., 2016)。在外文文献中,最早记录是1958年美国Eiseman等报道FMT治疗?#29616;?#20266;膜性肠炎(Eiseman et al., 1958)。 2013年,HMT首次被写入美国复发性CDI治疗指南(Surawicz et al., 2013)。关于FMT的越来越多的证据为肠道菌群相关疾病的治疗打开了一扇新的门(以适应证和方法学进步为依据)(表1)。

表1历史上使用粪菌移植的重要?#24405;?/strong>


 

从使用MICROBE到MICROBIOTA治病演变

上世纪微生物学家分离出许多株细菌并将它们作为益生菌使用。将细菌作为益生菌来使用已经有很长的历史(Brodmann et al., 2017)。然而,使用单一菌株治疗的临床益处是有限的(Milleret al., 2016)。尽管已有研究证明单一菌种在标准动物模型中的功效,但其在预防和治疗人类疾病方面仍存在不足(Gibson et al., 2017)。使用微生物治疗疾病的概念正在从单一的菌株向整体菌群发展(图1)。菌群移植(HMT)就是使用整体菌群的治病方法,但HMT的确有其局限性,如多变的方法学,美学和安全问题。现代HMT和古代HMT之间最明显的方法学差异在于离心、冷冻保存和自动纯化等方面。如?#26410;?#23384;粪菌仍然存在方法学上的挑战(Hale et al., 2016)。新?#36866;?#38598;的粪便必须立即处理,不能存储。冷冻的粪菌是用现代冷冻保存技术制备。有研究报道新鲜和冻存粪菌的临床疗效没有统计学差异(Tang et al., 2017),但这一发现主要来自于一些关于CDI治疗的试验(Hamilton et al., 2012; Lee et al., 2016)。在一项双盲研究中(Jiang etal., 2017),72名CDI患者肠镜下随机接受新鲜、冷冻或冻干的粪菌治疗,治愈率在接受新鲜粪菌组患者中最高(25/25,100%),在冻干组中最低(16/23,78%),冷冻组治愈率处于两者之间。冷冻的粪菌丢失了大量的细菌并?#21307;?#20302;了其治疗IBD的疗效(Cui et al., 2015a,b)。这就是在我们推荐使用新鲜粪菌进行HMT治疗的原因(He et al., 2017a,b; Zhang et al., 2017)。在其他中心同样观察到新鲜粪菌的高临床疗效(Uygun et al., 2017)。因此,必要时临床治疗的选择应考虑粪菌的保存方法。



图1 使用细菌治疗人类疾病的演变


菌群移植(HMT)到选择性菌群移植(SMT)

让患者理解菌群移植进入肠道的过程是容易的。最近一项有关患者针对HMT治疗态度的调查(Xu et al., 2016)表明:105例克罗恩病患者中有56.19%的患者获得满意的临床疗效,74.29%的患者愿意接受第二次HMT。此外,89.52%(94/105)的患者表明他们愿意向其他患者推荐HMT。这项研究首次提出了克罗恩病患者因为HMT的临床疗效而愿意接受它。此外,美国(Konijeti et al., 2014;Varier et al.,2015),加拿大(Waye etal., 2016),澳大利亚(Merlo et al., 2016),法国、英国使用HMT治疗CDI的几项成本效益分析(Baro et al., 2017),以及中国(Zhang etal.,  2017)使用HMT治疗IBD的成本效益分析均已经证明HMT有效降低医疗和社会成本的重要性。

 

然而,让患者接受将菌群移植到胃肠以外的器官并不容易。越来越多的证据显示出菌群在肠道以外部位具有潜在作用,如阴道(Klattet al., 2017),窦道(Schwartz et al., 2016),尿道(Tariq etal.,2017)和皮肤(Chu et al., 2017a,b)。因此,未来的研究应该专注于在不同器官中菌群的特定使用(Hoffmannet al., 2017a,b),称为选择性菌群移植(SMT)策略。当SMT用于模拟HMT时,将其命名为mini-HMT。表2显示了菌群移植在人类疾病中可能的应用。


表2 菌群移植在人类疾病中的可能运


因此,菌群移植包括整体菌群移植(例如:HMT)和选择性菌群移植SMT(例如?#33322;?#20110;传统益生菌和整体菌群之间的菌群组成)。SMT在精?#23478;?#23398;中具有发展潜力。


菌群移植途径

菌群移植的途径(图2)包括上消化道、中消化道和下消化道(Peng et al., 2016)。口服菌群?#32791;?#26159;一?#24535;?#19978;消化道的菌群移植方法。(Youngsteret al., 2014; Lee et al., 2016)。选定的菌群可以制成悬浮液或粉末。菌群悬液可以通过多种途径注入到十二指肠?#25105;?#19979;的小肠(Zhang et al., 2012a),包括经胃镜途径、经鼻空肠管(Cui et al., 2015a,b)、经内镜肠道植管术(TET)(Long et al., 2018),经小肠造口或经皮内窥镜胃空肠造口术(PEG-J)(Ni et al., 2016; Penget al., 2016)等。经中消化道TET是一?#20013;?#39062;、方便和安全的菌群移植途径,进而获得较高的患者满意度(Long et al., 2018)。菌群也可以通过下消化道,灌肠,远端回肠造口,结肠造口术,结肠TET等方式进行移植(Peng et al., 2016)。其中,结肠TET不影响患者的生活质量。98.1%的患者(53/54)对经结肠TET行HMT满意。结肠TET适用于需要频繁进行HMT治疗或除HMT以外还要与其他药物联合使用进行灌肠的患者。?#26434;?#27599;种移植途径,都应考虑美学因素以及患者的心理和隐私。 



图2 菌群移植途径

 

据报道的HMT有两起相关的死亡案例(Baxter et al., 2015; Goldenberg et al., 2018)。这两起案例的患者是死于HMT后发生的肺炎。这?#26893;?#21457;症可以通过以下临床工作流程避免:(1)在HMT前至少禁食4小时,并且HMT前1小时使用甲氧氯普胺(10毫克i.m.)增加肠道动力;(2)如果内镜不适合麻醉或患者病情危急,应插入鼻空肠管;(3)如果病人的情况允许并且已经插管,保?#26893;?#20154;坐位经中消化道行FMT;(4)左侧卧位(常规胃?#23548;?#26597;体位),并保持头高脚低,30度倾斜体位,而应避免水平位置;(5)确保患者的心理健康,取得患者知情同意、详细解释HMT的过程、监测HMT过程中的麻醉护理。确保患者在菌群移植过程中获得足够的心理照护。


菌群的实验室制备

实验室制备方法?#26434;贖MT的成功实施非常重要,可分为?#33268;?#27861;、?#33268;?#21152;离心富集法、微滤加离心富集法(He et al., 2017a,b)。例如,Hamilton在2012年的报道中所用的方法称为?#33268;?#21152;离心富集法(Hamilton et al., 2017a, b);


近期一项研究(Chu et al., 2017a, b)指出,一些制备方法可破坏活菌成分和粪便的适用性。普拉梭菌是一种与炎症性肠病相关的具有抗炎作用的肠道共生菌,一旦暴露于氧气其数量很快减少。事实上,手工制备一般在六小时内完成(Cammarota et al., 2017),称为“6小时方案”。基于自动纯化系统以及实验室技术人员和临床医生的密切合作,我们将从“供体排便到新鲜粪菌制备完成再到输注到患者肠道”或从“供体排便到粪菌制备完成再到粪菌冻存”的时间限制在1个小时以内(Cui et al., 2016; CalMaMa et al., 2017)。根据中国和其他国家的报道(Cui etal., 2015a, b; He et al., 2017a, b; Uygun et al., 2017; Zhang et al., 2017),“1小时方案”极大提高了H治疗IBD的临床疗效及成本-效果性。操作者很容易基于GenFMTer的自动纯化系统掌握“1小时方案”。


有益菌群的安全和质量控制

特定人群中HMT相关的不良?#24405;?#24212;得到预?#28291;?#23588;其是低免疫状态人群(Fischer et al., 2016a,b)。经中消化道行HMT治疗时,不恰当的菌群输注技术和流程可能导致患者发生恶心、呕吐、误吸等不良?#24405;℅weon et al., 2016; Furuya-Kanamori et al., 2017)。?#34987;?#32773;在麻醉状态下有较高误吸风险时,可以通过X线或其他非侵入性操作置入鼻空肠管后再行HMT治疗。腹泻和发热多在HMT后的3小时内发生,但通常不需要药物处理即可自行?#33322;猓–ui et al., 2015a, b)。

 

虽然目前证据不足,但HMT的长期安全?#26434;?#35813;得到重视。在移植了一名健康但是超重供体的菌群后,一名女性出现了新发的肥胖(Alang and Kelly 2005)。其他潜在的可能出现的心血管代谢性疾病、自身免疫性疾病和神经系统疾病也有相关报道(Brandt et al., 2012;Kelly et al., 2015)。Wong等(2017)报道移植结肠癌患者的粪菌可促进无菌和致癌小鼠的肿瘤形成。因此,为了预防经HMT传播疾病,应进行严格的供体筛选。美国胃肠病学会(AGA)正在使用来自国家注册中心的数据以制定一个长期计划来评估HMT治疗CDI的风险和获益(Kelly et al., 2017)。中华粪菌库(www. fmtbank.org)正在支持中国菌群移植体平台登记信息(Cui and Zhang, 2018),涵盖HMT的治疗决策、方法、短期和十年长期随访的安全性评估。


HMT使用策略:HMT升阶治疗策略

新鲜菌群移植对CDI的主要和?#25105;?#27835;愈率分别为91%和98%(Brandt et al,2012)。在另一项RCT研究中,首次HMT及随后重复HMT治疗后就CDI的主要治愈率和?#25105;?#27835;愈率分别变成了81%和94%(Van Nood et al,2013)。利用冻存粪菌治疗CDI已经被证实和新鲜粪菌有着相近的疗效(Hamilton et al,2012; Lee et al,2016)。一项基于80名患者的分析表明,HMT对免疫功能低下的患者仍然?#21069;?#20840;的(Kelly et al,2014)。多变量分析(Fischer et al,2016a,b)结果提示,早期可用以预测HMT失败的因素包括?#29616;?复杂的CDI,HMT期间的住院状态和既往与CDI相关的住院经历。

 

?#29616;?复杂的CDI可致患者需要重症监护,引起败血症,中毒性巨结肠甚?#20102;?#20129;。对此类患者而言,标准的治疗策略为结肠切除术,但死亡?#35797;?#20026;50%。Fischer?#28909;?#25253;道了(Fischer et al,2015)29例高结肠切除风险的?#29616;?#22797;?#26377;訡DI患者接受HMT联合万古霉素治疗的研究, 62%的患者接受单次HMT治疗,38%的患者接受多次HMT治疗(31%的患者接受了两次HMT,7%的患者接受了三次HMTs)。结果显示HMT和后续的万古霉素治疗提高了特定患者的治愈率。

 

HMT可?#26434;?#29992;于CDI的治疗且效果良好,但有关IBD及其他疾病的临床证据尚存在许多争议。Paramsothy?#28909;耍?017)报道表明强化剂量和多重供体的HMT治疗可诱导活动性溃疡性结肠炎的临床?#33322;?#24182;观察到内镜下改善,而这种治疗与微生物组成的显著改变有关。He ?#28909;?#26368;近报道在首次HMT后三个月接受第二次新鲜HMT,是一种安全有效的维持克罗恩病患者长期临床?#33322;?#30340;治疗方法(He et al., 2017a, b)。在该研究中HMT流程依照“1小时HMT方案”执行,建议所有患者在接受第一次HMT治疗后,每三个月重复接受一次HMT治疗。在首次HMT后第3个月,分别有68.0%(17/25)和52.0%(13/25)的患者达到临床改善和临床?#33322;狻?#32780;在治疗后6个月,12个月,以及18个月仍维持临床?#33322;?#30149;人的比例分别为48.0%(12/25),32.0%(8/25)和22.7%(5/22),有9.5%(2/21)的病人达?#25509;?#20687;学?#33322;猓?1.4%(15/21)的患者达?#25509;?#20687;学改善。由此可得出结论:序贯的多次新鲜HMT治疗可有效诱导并维持克罗恩病合并腹部炎性包块患者的临床?#33322;狻?/span>

 

在最近的一项前瞻性研究中(Cui et al,2015a,b),57.1%(8/14)的患者在接受了HMT升阶治疗策略(Step-up HMT)后停止了使用激素并获得了临床改善。这8名应答者中,5例(35.7%)接受了单次HMT治疗,1例(7.1%)接受了两次HMTs,2例(14.2%)接受的是两次HMTs联合定期的激素治疗。6例患者(42.9%)未能达到临床改善并存在激素依赖,尽管其中3例患者在治疗期间出现过短暂的或部分的临床改善。整个治疗和随访期间未观察到?#29616;?#19981;良?#24405;?#30340;发生。HMT升阶治疗策略作为整?#29616;?#30103;学概念(Fan, 2017),体现了激素依赖IBD患者的特殊性(Cui et al,2015a,b,2016)。我们通过3,000多例CDI、IBD和其他疾病的治疗经验,进一步证明了HMT的升阶治疗策略的价值。



图3 HMT升阶治疗策略

 

如图3所示,HMT升阶治疗策略由三部分组成:第一步是指单次HMT; 第二步是指多次HMTs(≥2); 第三步是指在步骤1或步骤2无效时,HMT联合常规药物治疗(例如糖皮?#22987;?#32032;,环孢素,抗TNF-?#37327;?#20307;,全肠内营养)。每一步的疗效都可在下一步中得以提高,第三步之所以继续使用常规药物治疗,是因为肠道菌群重建改变了宿主的免疫状态,肠道屏障功能以及对常规治疗药物的敏?#34892;浴?#35813;HMT升阶治疗策略适合于难治性IBD、免疫相关性疾病(Cui et al., 2015a, b, 2016)和?#29616;?#25110;复杂的CDI (Fischer et al., 2015),特别是对常规治疗药物无应答的患者。

 

越来越多的证据强调了制定如第1、2和3阶?#21361;?#22270;3)的治疗阶梯的必要性。第一?#37237;?#24120;涉及单次HMT治疗CDI或者难治性的肠道感染(Surawicz et al,2013; Wei et al,2016)。第二步是指多次HMT,通常涉及治疗IBD患者(Cui et al,2015a,b,2016)和部分难治性CDI(Lee et al,2014)。最近,Suskind?#28909;?#25253;道了9例克罗恩病患者经鼻空肠管接受多次FMT治疗的研究(Suskind et al,2015),有77.8%(7/9)的患者两周后达到临床?#33322;猓?例患者在12周后停用了其他药物。Seth等(2016年)报道利用多次HMT治疗可维持溃疡性结肠炎患者达到临床和内镜下?#33322;?#36229;过8个月。Liu?#28909;耍?017)报道利用多次HMT治疗诱导17例过敏性肠炎患儿临床症状的?#33322;狻?/span>

 

?#26434;?#28608;素依赖的IBD病人在多次HMT后再使用激素治疗的策略(即step 3)得到许多临床研究的支持。Shimizu等(2016)报道一例大剂量激素依赖并且抗肿瘤坏死因?#24212;?#27835;疗无效的溃疡性结肠炎儿童在多次HMTs后获得临床?#33322;?#24182;?#21307;?#20302;了激素依?#23548;?#37327;。此外,该策略在不适合激素治疗的?#29616;?#37202;精性肝病(Philips et al., 2017)和存在激素抵抗的急性移植物抗宿主病(Kakihana et al., 2016)的治疗中也具有疗效。上述报道,包括Fisher关于?#29616;谻DI(Fischer et al.,2015)的研究在内,展示了这一治疗策略(step-up HMT)治疗更多菌群相关疾病的潜力,特别是疾病的复发和难治状态。



图4 制备菌群的GMP实验室


利用菌群移植治疗肿瘤新策略

近年来,越来越多的研究报道,在重建患者肠道菌群后再行免疫治疗、化疗和放疗可能成为有希望的肿瘤治疗策略。一项新的研究发现,肠道菌群重建能够改善基于PD-1的抗肿瘤免疫治疗的疗效(Routy et al., 2018),表明HMT能够有助于对抗肿瘤。研究发现,转移性黑色素瘤患者对抗PD-L1治疗的临床?#20174;?#21644;肠道菌群的变化相关(Matson et al., 2018)。抗PD-L1治疗有?#20174;?#30340;患者有丰富的菌种组成,如双歧杆菌、产气柯林斯菌和肠球菌等。将有?#20174;?#24739;者的粪菌移植给无菌小鼠,进行抗PD-L1治疗后发现有着更好的抑制肿瘤作用、更强的T细胞效应。另一项研究(Gopalakrishnan et al., 2018)也证明肿瘤患者在增强全身免疫力和调节肠道菌群结构后对PD-1免疫治?#21697;从?#26356;好,接受有?#20174;?#24739;者粪菌移植的无菌小鼠也是一样。美国食品和药物管理局(FDA)根据一些注册实验通过了抗PD-1和抗PD-L1治疗的适应证(Gong et al., 2018)。另一项研究表明,肠道菌群还能?#25381;?#21709;CTL-4免疫疗法的抗肿瘤?#20174;Γ╒etizouet et al., 2015)。生物信息学和功能研究证明了Fusobacterium nucleatum能够增强结直肠癌的化疗作用(Yu  et  al., 2017)。Enterococcushirae和Barnesiella intestinihominis能够增强环磷酰胺诱导的针对肿瘤治疗的免疫调节作用(Daillere  et  al., 2016)。在临床实践中可以对微生物菌群进行重建,以提高其疗效,减少这些化合物的毒性负担(Alexander et al., 2017)。放射治疗对肠道菌群的影响,以及放射治疗后维持微生物平衡的临床意义逐渐受到重视(Ferreira et al., 2014)。HMT可以减轻辐射诱导的毒性,提高辐照小鼠的存活率。在此过程中,外周血白细胞计数、胃肠道功能和肠上皮完整性得到有效改善(Cui et al., 2017)。上述人、动物和体外实验的研究表明,在调节癌症进展和药物?#20174;?#26041;面,HMT升阶治疗策略是一个有前途的治疗策略。在应用配方菌群移植的新时代,SMT治疗癌症的策略将与HMT升阶治疗策略相同。


HMT的安全监管进展

?#29616;?#19981;良?#24405;?#21487;由供体粪便中的感染性微生物引起。因此,HMT的实验室条件应满足制药公司生产口服药物的生产要求(GMP)(图4)。不够条件人、动物或生物样本必须排除在外。因此,快速、准确、方便的粪便病原体检测方法必不可少(Hoffmann et al., 2017a, b)。为了确保对不良?#24405;?#21407;因的可追溯性,捐赠的粪便样本应该低温保存至少两年(Cui etal., 2016)。虽然HMT相关的短期不良?#24405;?#21457;生率?#31995;?Wang et al., 2016),但对HMT安全性的长期评价应该持续进行。这也是美国开展全国注册HMT项?#31185;?#20272; (Kelly et al., 2017)和中国建立菌群移植平台都致力于长期评估HMT安全性的意义。此外,政府应当对HMT进行?#23454;?#21644;有效的监管,以保护患者和捐赠者,促进相关研究的发展,同时避免HMT在治疗疾病方面的滥用 (Ma et al.,2017)。


总结

综上所述,用微生物治病,在理念上的主要变化是将菌群作为一个有机整合的整体。HMT改变了我们对与微生物相关疾病机制和治疗的认识。?#26893;?#30340;HMT终将过去,标准化HMT成为主流治疗方案的时代即将到来,并将为更多的患者带来益处。HMT的适应证将会覆盖CDI以外的更多疾病。在不久的将来,针对特定器官的SMT将成为可期待的治疗选择。菌群移植的策略将引起更多生物医学研究者和临床决策者的关注并让更多人获益。

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